产品货号:
KFS333
中文名称:
PCNA细胞增殖检测试剂盒(IHC法)
英文名称:
PCNA cell proliferation Detection Kit(IHC)
产品规格:
50T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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PCNA是细胞DNA多聚酶的“δ”辅助蛋白,是真核细胞DNA合成时所必需的一种酸性核蛋白。PCNA在细胞核内合成,并储存在核内,细胞处于静止状态时,其含量很低,当细胞进入增殖周期中,其表达明显增加,故PCNA的表达高低可反映细胞增殖的活跃程度。在活检或手术切除的组织切片或细胞涂片上,用免疫技术检测到PCNA表达增高有助于肿瘤组织的诊断。
组分 | 规格 | 保存条件 |
anti-PCNA antibody,mouse IgG(1μg/μL) | 50μL | 2~8℃ |
试剂A:10%山羊血清封闭液 | 3mL | |
试剂B:抗小鼠生物素化二抗 | 3mL | |
试剂C:链亲和素标记HRP | 3mL | -20℃,避光 |
试剂D:浓缩DAB显色液 | 108μL | 2~8℃,避光 |
试剂E:DAB底物缓冲液 | 3.6mL |
保存:-20℃,避光,有效期1年。
- 仪器:微量移液器、低速离心机、平板摇床、微量移液器、光学显微镜、1.5m L Micro-tube。
- 试剂:4%多聚甲醛、去离子水、PBS(10mM,pH7.4)、30%过氧化氢溶液、二甲苯、甲醇、乙醇、苏木素染液、BSA、封片胶。
- 梯度酒精溶液:50%→70%→80%→90%→95%→100%。
- 细胞通透液0.1% Trition X-100:0.01mL Trition X-100加到9.99mL dH2O中。
- 抗体稀释液PBS-1% BSA:0.1mg BSA溶于10mL PBS。
- 抗原修复液(石蜡包埋的切片组织适用):0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH6.0(可选)。
- 内源性HRP酶灭活液:3% H2O2-甲醇。
- 细胞样本
- 细胞固定:将爬有细胞的盖玻片用PBS洗两遍,然后加入4%的多聚甲醛固定1h-2h。
- 水化:将固定好的细胞爬片加几滴PBS覆盖15分钟,然后用PBS洗三遍。
- 通透:在爬片上加细胞通透液(0.1% Triton -X),冰上放置5分钟。
- 洗涤:以洗涤液浸泡5分钟,清洗3次。
- 细胞固定:将爬有细胞的盖玻片用PBS洗两遍,然后加入4%的多聚甲醛固定1h-2h。
- 组织样本
- 预处理:在脱蜡之前,将切片60℃恒温箱中烘烤60分钟。
- 脱蜡:将切片用二甲苯浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟。
- 水化:分别用无水乙醇中浸泡5分钟;95%乙醇中浸泡5分钟;85%乙醇中浸泡5分钟;70%乙醇中浸泡5分钟。
- 洗涤:PBS浸泡5分钟,清洗3次。
- 抗原修复:将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的烧杯中,高火档至煮沸,将烧杯取出置于电热器上保持微沸状态20分钟,而后将烧杯浸入流水中(不可将玻片从缓冲液中取出冷却),自然冷却。
- 洗涤:PBS浸泡5分钟,清洗3次。
- 预处理:在脱蜡之前,将切片60℃恒温箱中烘烤60分钟。
- 免疫反应检测
- 内源性HRP酶灭活:滴加内源性HRP酶灭活液覆盖样本,冰上放置5分钟。
- 洗涤:PBS浸泡2分钟,清洗3次。
- 封闭:每片滴加50~100μL的试剂A,37度湿盒孵育10分钟后,再以洗涤液浸泡2分钟,清洗3次。
- 一抗孵育:以预先配置好的抗体稀释液稀释一抗,现用现配。加入一抗100μL(以可覆盖样本为准),每片1μg抗体。37℃,湿盒孵育1小时。
- 洗涤:以PBS浸泡2分钟,清洗3次。
- 二抗孵育:滴加50μL试剂B覆盖样本,37℃湿盒孵育10分钟。
- 洗涤:PBS浸泡2分钟,清洗5次。
- 链接:每片滴加50μL试剂C覆盖样本,37℃湿盒孵育10分钟
- DAB法显色:制备DAB显色液(现用现配,参见附表1),每片加一滴,室温显色2~5min。
- 终止显色:镜下观察染色深浅,染好立即中止,用自来水轻柔冲洗15分钟用蒸馏水终止显色反应。
- 复染:将切片放入苏木素染液,染色5min,用蒸馏水冲洗干净。
- 封片:1%盐酸酒精分化20秒,立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%酒精浸泡5分钟;85%乙醇中浸泡5分钟;95%乙醇中浸泡5分钟;无水乙醇乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡5分钟,更换二甲苯后再浸泡5分钟。晾干后在切片上加中性树胶,加盖玻片。
- 观察:光学显微镜检测,拍照。
- 内源性HRP酶灭活:滴加内源性HRP酶灭活液覆盖样本,冰上放置5分钟。
附表1:配制DAB显色液所需试剂D、E用量表
切片数(张) | 试剂D | 试剂E |
1 | 1.8μL | 60μL |
2 | 3.6μL | 120μL |
3 | 5.4μL | 180μL |
4 | 7.2μL | 240μL |
5 | 9μL | 300μL |
6 | 10.8μL | 360μL |
7 | 12.6μL | 420μL |
8 | 14.4μL | 480μL |
9 | 16.2μL | 540μL |
10 | 18μL | 600μL |
20 | 36μL | 1.2mL |
30 | 54μL | 1.8mL |
40 | 72μL | 2.4mL |
50 | 90μL | 3mL |
60 | 108μL | 3.6mL |
100 | 180μL | 6mL |
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